Leber氏遗传性视神经病变

作者  中国中医科学院眼科医院 王影吉林省人民医院眼科李晓明

Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy LHON)是一种最常见的线粒体疾病。本病由Von Graefe等于1858年首先报告。1871年 Teodor Leber于16个家系中收集55例，确认为一独立的遗传性疾病。该病的病理机制一直不清，1988年 Wallance等明确线粒体DNA突变与该病密切相关，这为LHON病理机制的研究翻开新的一页。但该病遗传关系、外显率及病理机制方面仍存在很多疑问有待于进一步研究。本文谨对LHON发病机理及临床研究做一综述。

1.临床研究

1.1 流行病学

LHON是母系遗传性疾病，男性多发，西方发病率男女比率为3：1或9：1，我国约为6：4，显示黄种女性发病率有增多现象。该病发生多在青春期（18-23岁），最小可在1岁，最大70岁。我国尚无明确的该病发生率报道。在英国北部1：25,000【1】，芬兰是1：40,000【2】。公认的LHON原发突变位点有三个，分别是11778、14484和3460，这三个位点突变率约占所有LHON患者的90％，国人患者的11778位点突变约占66％。高加索LHON患者中11778突变大约占69%, T14484C 和 G3460A 分别占14% 和13%【2】。在欧洲，G11778A突变大约50%，G3460A和T14484C突变分别占35%和20%。在日本LHON11778位点突变可达91.7％或87％，其余两突变位点则较少见。这些调查结果表明该病在发病率及突变位点中存在种族差异。

1.2 临床表现

1.2.1 临床症状

通常LHON患者发病时无明显诱因，部分有体温升高或疲劳【2】，临床上主要表现为双眼同时或先后急性或亚急性中心视野缺失,而色觉丧失多在视力下降之前，发病时患者通常没有明显不适，少数会有眼部疼痛或转眼时的牵扯痛。LHON患者还可伴有震颤、共济失调、肌张力障碍、脊髓皮质束功能障碍、耳聋和骨骼畸形等异常，以及类似多发性硬化的一种综合症。部分患者还伴有心脏功能障碍，有研究者认为这些患者的心功能治疗同时有利于眼部病变的恢复【3】。左炜等观察30例LHON患者中有53.3％有心电图异常【4】。看来，LHON除眼部症状外还累及全身诸多器官系统。

1.2.2 临床分期

1996年，Nikoskelainen著写的《眼科学》中将该病大致分为三期: (1) 临床前期: 视盘充血水肿,视盘上及邻近区微血管扩张弯曲明显,绕盘周神经纤维层水肿混浊；FFA 见静脉充盈迅速, 动静脉分流, 但无渗漏。(2) 急性期: 上述体征更明显, 有时可见盘周出血；FFA 显示充盈时间更快, 视盘颞上下方为主有丰富的动静脉分流枝, 颞侧部分血管壁可出现荧光滞留现象, 而盘斑束的血管床减少, 充盈迟缓。(3) 萎缩期: 视盘颞侧小动脉变细, 毛细血管减少, 神经纤维的带状或楔形缺失区逐渐加宽, 视盘颞侧变淡白；随病程进展上述改变范围更大并累及全视盘及周围神经纤维层。我国临床对本病尚无明确分期。该病早期诊断是困难的但对于治疗和预后是重要的。

1.2.3 物理检查

LHON患者的早期视觉诱发电位（VEP）无明显改变，后期可有振幅的下降或潜伏期的延迟。视网膜血管荧光造影在急性期无荧光渗漏，成为辅助临床诊断的指标之一。Smith认为该病早期视乳头周围毛细血管扩张性微动脉血管改变，视乳头周围神经纤维层肿胀，视乳头无渗漏，是LHON患者的三联症。其后被各国学者证实，已作为LHON的经典概念。脑和视神经的核磁共振检查是正常的, 但用瞬时翻转信号扫描表现常有神经胶质过多症的变化【5】。Giacomo【6】利用OCT检查发现，所有未发病LHON患者视神经纤维层厚度均较对照组薄，发病患者颞侧象限最先受累，男性视神经纤维弥漫性损伤较女性明显。我国尚无此项检查的相应报道。

1.3 诊断标准

LHON尚无明确的诊断标准，研究认为通过外周血基因诊断该病是最简单的，但由于外周血与视神经线粒体基因突变率是不同的，容易出现假阴性结果，因此对于该病的诊断应同时与临床表现相结合，家族遗传史、发病年龄及眼底三联症表现尤为重要。即使未查出LHON原发三个位点，或虽无明确家族遗传史，若有上述临床表现也应高度怀疑为该病。全基因扫描的应用有一定临床价值，我们临床上已屡见新的突变位点。

2.病理机制

2.1 基因背景

线粒体间质、内膜、外膜、内外膜间空隙都储存多种酶或酶群。基质含线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）、复制和转录mtDNA所必需的蛋白质、蛋白质合成的线粒体核糖体和实现其他功能（指柠檬酸循环和脂肪酸的β氧化作用）的酶。人类线粒体DNA为一含有16569个碱基对的环状双链闭环分子。mtDNA能自身复制，成为独立于染色体外的遗传系统。其含有两条DNA链，一条轻链，另一条重链，两条链都有编码功能。mtDNA共编码二类rRNA, 22种tRNA和包含13条多肽链的mRNA（细胞色素B、细胞色素C、氧化酶的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 亚单位，ATP酶亚单位6和8两种成分及呼吸链NADH脱氢酶的7个亚单位：ND1、ND2、ND3、ND4、NDL4、ND5、ND6）。仅有复合物Ⅱ（琥珀酸脱氢酶）是完全由核DNA编码的。因而线粒体基因组在调节氧化磷酸化作用中起关键作用。大部分线粒体蛋白由核基因组编码，在胞浆内转化并引入线粒体。因此核基因在线粒体功能中也起着重要作用。

线粒体的遗传特征：（1）母系遗传  由于线粒体位于细胞质内，父方仅有核基因进入卵子形成配子，受精卵中的线粒体绝大多数均来自于母亲，因此线粒体疾病多数为母系遗传。（2）异质性  mtDNA基因排列紧凑，某些基因可相互重叠，除一个87bp处于超纵子之间被称为D袢的区域之外，几乎每个均用于组件基因。与核基因不同，一个线粒体中有1-10个mtDNA，每个细胞中有成百上千个mtDNA拷贝，每个细胞内所有mtDNA分子是一致的，称为同质性；而当mtDNA发生突变时就会导致细胞内野生型与突变型两种mtDNA同时存在，称为异质性。（3）mtDNA突变的表型表达   mtDNA突变的表型表达与核基因的表达不同，主要由某种组织中突变型与野生型mtDNA的相对比例及该组织中对线粒体的ATP产生的依赖程度所决定。当突变型mtDNA的数目达到某种程度，能足以引起某器官或组织的功能异常时，则称为阈值效应。也就是说突变mtDNA是否在组织产生表型效应，这要依突变mtDNA与正常mtDNA相对比例和该组织对线粒体产生的ATP依赖程度而定。突变型mtDNA在不同组织中的差别表达与这些组织对线粒体能量的依赖程度关系密切，中枢神经系统、视网膜、心脏、骨骼肌和肝脏对能量的依赖性较高，氧化磷酸化功能缺陷往往在这些组织表现明显。（4）mtDNA突变的发生频率高   mtDNA突变的发生频率要比核基因高16倍以上，由于其缺乏完整的修复系统，故随着年龄的增加体细胞内mtDNA突变会逐渐积累，氧化磷酸化功能也不断下降，甚至能量产生低于组织能量需求的阈值，即出现临床症状。（5）突变类型   线粒体突变分为，错义突变、生物合成突变、缺失突变和拷贝数突变。迄今所有LHON突变均为复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的氧化磷酸化亚单位的错义突变。（6）遗传趋势   mtDNA复制速度在单位时间内与它的长度呈正比，mtDNA暴露在细胞质中容易受到氧化损伤产生各种突变，同时又缺乏酶的保护，因此发生了突变的   mtDNA与正常大小的mtDNA相比具有增殖优势，也就是说随着时间的延长，异常的mtDNA有在体细胞内积累的趋势。

线粒体基因的遗传特征与LHON疾病的发生密切相关，研究认为LHON的病理机制主要有以下因素有关。

2.2 LHON发病机制

1988年Wallance发现LHON患者线粒体脱氧核糖核酸第11778位点突变，即鸟苷酸（G）被腺嘌呤（A）替代，此突变使呼吸链上还原型辅I（NADH）脱氧酶亚单位4（ND4）基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸，这一位置的氨基酸是人类从鞭毛虫进化到现在一直保留的，因此具有高度的保守性。1991年，Huoponen等又发现一种新的mtDNA突变：ND1基因3460位引起丙氨酸变为苏氨酸，并证实肯定与LHON相关。Johns等在14个LHON病人首次发现ND6基因14484位点突变，在这14个家系中除该位点突变外,相继发生的还有13708等位点突变。研究认为这些突变可能降低电子流动效率而影响酶的活性，从而减少神经细胞ATP的产生，细胞功能逐渐丧失，从而导致患者视力受损。Yen氏[7]等将该病的线粒体基因突变分为四组，主要突变组包括3460、11778和14484；罕见位点2个，14459、14495；假设可能突变位点有11个，伴发突变位点有9个，合计有25个。这些突变基因主要位于mtDNA内的NADH脱氢酶上。除了11778、14484和3460之外，其他突变位点也可能是原发的，但其机制欠清。虽然一些研究者认为LHON突变的多发性对于视力丧失是必要条件，但尚未证明。事实上，有研究者发现携带两个主要突变基因尚未发病的患者【8】。还可能LHON细胞内存在一些潜在的mtDNA单倍体虽然不是表形表达的主要因素，但影响着mtDNA突变位点的存在、表型或表达【9】。

有研究发现这三个主要突变位点的所有患者，均有辅酶Q10底物与复合酶I的交互作用障碍，因此认为LHON的突变可能影响了辅酶Q结合位点及泛醌中间产物而导致稳定性下降【10】。另一个因素，线粒体呼吸链是需氧细胞、95%超氧离子的发源地。细胞的呼吸链抑制可以引起自由基代谢的增加，氧化损伤反过来又可以抑制呼吸链。这种氧化损伤和呼吸链功能障碍的自我扩张循环趋势，可以导致线粒体损伤，尤其是对线粒体损伤极为敏感的中枢神经组织。还有研究认为筛板前无髓鞘的视神经部分线粒体呼吸活动程度较高。这部分视觉系统对线粒体功能障碍尤其是辅酶I的异常可能较为敏感。

导致携带者是否发病的主因尚不清楚，核编码因素、线粒体产物或线粒体的新陈代谢均可能影响LHON表型表达。但从线粒体生理特征来看可能与以下几点有关：

（1）粒体在各组织的不同分布和瓶颈现象  在卵母细胞早期阶段，mtDNA分子数量由减少到几百后增长到成熟卵母细胞的约十万，因此卵母细胞可有不同的突变水平。所以通过母亲预测子代基因突变水平或是否发病是困难的。

（2）年龄因素的影响  mtDNA突变的高发生频率，随着年龄的增加体细胞内mtDNA突变会逐渐积累，氧化磷酸化功能不断下降，视神经对能量的需求比一般的组织要高，这可能是视神经为主要受累组织的原因之一。在个体中组织能量的利用和储存也决定着视力丧失的时间和范围。随着年龄增长，线粒体能量产物的下降， LHON患者视力丧失发生的时间可能反映线粒体功能恶化临界水平的域值。

（3）遗传的异质性  Howell等【11】研究英国一跨越了六代的LHON家系。在这家系中，有两支有11778突变位点表现为复杂的种族隔离模式，另外一支同质野生型，有四支为异质状态。进而，有等位基因11778的联合——种族分离，以及在家族中18和19患者核苷5471位点G:A不外显的多态性。这种在相同mtDNA分子中的联合——种族分离现象显示两种替代同时或几乎是同时发生。然而，在一个家庭中的较高分歧线粒体等位基因率暗示在这两种替代中有复杂的起源和分歧史。总之在此家系的一分支中，媒介随后分离突变基因型到较高的水平，在另一分支，有双倍的野生型或突变型成为基本上的同质型。在几个发病和未发病的家系中，LHON原发性突变的异质性程度可能与视力丧失的危险性有关，然而在绝大多数经分子鉴定为LHON患者中，仅少数发病患者血中检测到异质性【12】。

（4）内在和外在的环境因素  系统疾病、营养缺乏、药物作用、或毒素它们直接或间接抑制线粒体代谢，从而引发或增加疾病表形表达。慢性中毒与环境因素的研究较多，迄今所有LHON突变均为复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的氧化磷酸化亚单位的错义突变。LHON患者可能出现氧化磷酸化的异常，线粒体内氧化物和硫氰酸酶活性发生障碍，当长期吸烟、摄入含氰物质、环境污染等, 使患者体内氰化物堆积，久之可抑制细胞的细胞色素C氧化酶，进一步加重线粒体基因突变后氧化磷酸障碍，从而使发病几率增加。但研究发现用氰化物解毒剂羧钴胺及硫代硫酸钠等治疗未能阻止本病病程发展及视功能损害。因此该研究尚有待深入。尤其在营养明显缺乏的古巴并没有表现11778突变位点LHON患者发病的增加【13】。虽然一无对照组试验暗示烟草和过度酒精可促使视力下降，一大样本对照研究未能证明这一结论【14】。其他对LHON有害的因子如：乙胺丁醇,有学者认为抗病毒治疗对LHON突变患者也可能是有害的。Alfredoa【15】在研究LHON发病危险因素中发现，吸烟是该病患者的高危因素，但高血压和高胆固醇血症的发生率却比对照组低。国内尚无相关研究的报道，这一结果尚有待深入研究。Yen等〔16〕报告内分泌失调, 如生育、胰岛素依赖型糖尿病等可诱发LHON，若能及时纠正这种内分泌失调可使部分患者的视力获得一定程度的恢复。

（5）多发性硬化　除了基因分析以外的辅助检查，评价LHON时通常是有限的。除了那些暗示有多发性硬化和那些有肌张力障碍和基底神经节损害的家系，在LHON患者的CT和MRI检查是正常的。1992 年Harding 等首次发现能导致LHON的线粒体DNA 突变也见于MS患者, 随后欧美国家的研究人员对线粒体DNA 突变与MS的关系进行了大量的研究, 结果表明, 引起LHON的3个原发性线粒体DNA 突变位点11778、3460、14484 均可存在于MS患者, 其中以11778 突变最为常见。一个男孩有视力损害但没有暗示脱髓鞘疾病的症状和体征，但却发现有广泛T2高信号脑室白质的改变【17】。两名LHON患者在CT、MRI和眶部超声检查时发现有视神经鞘的扩张【18】。在LHON患者急性视力丧失阶段MRI检查通常是正常的，而在几个月后眶内段视神经表现为MRI的T2高信号【19】。与此相反, 亚洲地区不但少见报道(仅见于日本) , 而且结果迥异, 认为mtDNA突变与MS发病无关【20】。周珏倩【21】检测18 例MS患者外周血线粒体DNA 11778 突变。结果未能检测出MS患者线粒体DNA突变。作者推测这可能与亚洲MS患者发病率明显低于欧洲有关。

2.3 LHON与细胞凋亡

近年来mtDNA与细胞凋亡之间的相关性研究日益受到重视。Pitkeane等发现细胞培养过程中,如果呼吸链中NADH脱氢酶复合体缺陷,则细胞可产生大量超氧化物。用抗-Fas处理引起LHON的细胞系及与复合体 缺陷有关的mtDNA突变细胞系,更易被诱导凋亡【22】。Danielson等【23】研究发现突变位点在3460和11778的LHON患者对Fas所引发的细胞凋亡具有敏感性,推断细胞凋亡在LHON神经损伤过程中起着重要作用,而这种凋亡与氧化损伤有关。Mashima【24】为明确氧化应激与凋亡是否能引起该病患者的临床变化，发现在EPHX1基因携带纯合的His113和在TP53 基因上有纯合的Arg 72的该病患者，发病早于那些没有这些基因型的患者，因此认为核基因调控的与氧化应激和凋亡相关的多态现象可以改变该病患者的发病年龄。Floreani等【25】研究发现尽管在所有LHON患者的胞质体中有超氧化物岐化酶的减少，在有严重3460和11778突变的LHON患者血细胞中GPx和GR的活性降低，然而在所有LHON患者的胞质体中GR和MnSOD活性都下降。这些结果暗示，在LHON有突变位点的细胞中，有抗氧化功能的降低，尤其是有明显临床表型突变的细胞，在暴露在半乳糖等氧化应激的环境中这种损伤更加明显。Battisti等【26】，利用电镜、血流变、琼脂凝胶电泳和线粒体膜电位检测来检查6LHON患者和6正常人，结果LHON患者比对照组凋亡率高，在凋亡过程中有线粒体被涉及。从而提出不同的氧化损伤与氧化还原动态平衡在不同个体基因突变表达中的重要作用有线性关系。

研究认为该病患者的线粒体基因突变使得一些组织器官的呼吸功能受限，因此该病与氧化损伤密切相关。OzawaT认为mtDNA氧化损伤及其引起的突变使氧化磷酸化基因受损,又使与呼吸链有关的酶出现异常,造成线粒体氧化磷酸化功能障碍,促进活性氧(ROS)产生,进一步使呼吸链功能失衡,如此循环最终导致细胞死亡。自由基攻击mtDNA碱基的方式主要是直接使碱基氧化修饰，氧化修饰后的碱基在复制过程中容易出现错配而导致突变［27］。王剑勇等【28】对11778点突变的LHON家系行血清一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)检测,结果患者的NOS高于携带者。在研究LHON家系人群中自由基、抗氧化物的变化时发现，无论是病人还是正常携带者与正常组相比,血清超氧化物岐化酶（SOD）水平均显著增高,且病人谷胱甘肽（GSH）明显高于正常组,而血清谷胱甘肽-转移酶（GST）、GSH水平LHON正常携带者则低于正常对照组【29】,这些研究尚有待于进一步观察。

３.实验室研究                                      

迄今尚无LHON早期视神经病理报道，因此定位和原始损伤尚不十分清楚。Kerrison 等【30】在一81岁澳大利亚LHON女患者尸检中发现，视神经纤维、视神经节细胞层和视神经萎缩。电镜检查显示神经节细胞内涵物里有局限在双层膜上的钙，暗示存在线粒体钙化。三个急性视力丧失多年的患者的组织病理学和形态学分析，结果是严重广泛的视神经纤维缺失。仅遗留外周和原发较大直径的神经纤维束. 纤维囊性斑痕化，散在变性颗粒（degeneration dust）和轻微炎症表现。这一研究者提出选择性神经节细胞（P细胞——起博细胞，永存细胞，持续细胞）丧失【31】。

    在线粒体突变疾病的研究中，尚无合适的动物模型。转线粒体细胞模型则是现代研究线粒体突变疾病的主要手段。该模型通过脱核的胞质体与缺乏线粒体DNA的ρ°细胞融合引入外源性目的的mtDNA，用选择培养基挑出融合细胞，然后采用一系列方法来评价融合细胞功能表现和外源性目的mtDNA生物学致病机理。1996年，Jun利用转线粒体细胞模型来研究14459位点突变LHON患者线粒体复合酶Ⅰ活性，结果发现该酶活性下降了39%【32】。

４.治疗与预后

在LHON表型表达上尚有许多问题，不同突变位点表现相近似的临床表现，三个主要位点突变表型中都存在自发视力恢复现象。但恢复率却是不同的，在136个患者中11778位点突变仅有4％有自发恢复现象【33】；14484有37-65％。另外14484患者的视敏度要明显好于11778和3460突变位点的患者。 Oostra[34]研究11778、3460、14484三个原发性突变LHON患者的视力预后方面,14484位点视力预后最好,其次是3460位点,11778位点突变患者的视力预后最差。在澳大利亚、荷兰、美国,随访观察视力丧失患者2年,发现伴有14484位点突变的患者视力恢复率高。童绎等 [35]研究发现Leber病有或无Wallace突变对视力恢复预测无意义,伴有严重神经系统并发症者常无11778位点突变。总之，对于一些LHON患者视力自发性恢复，任何无对照的疗效报告，必须是慎重的。这种自发性恢复机制尚不清楚，同时长期随访观察以明确是否真正的自发恢复也是十分必要的。

对LHON目前尚无特效疗法。六十年代末日本提倡的对LHON患者采用交叉蛛网膜粘连松解的颅骨切除术，超过120例约80％患者有视力提高，但很难相信利用外科手术改变视神经血管状态即可得到如此的有效率。临床上常见因激素冲击疗法无效后,才意识到该病可能与LHON有关的现象。一些研究认为线粒体代谢中自然存在的具有抗氧化功能的辅助因子，如辅酶Q10、琥珀酸盐、维生素K1、K3、C、B1及B2对视力恢复起辅助作用。据1999年Yoles报道28例LHON患者中14例由艾地苯醌（对苯二酚）联合维生素B2、C，在视力恢复上眼睛的数量没有差别。左炜等利用中西医结合疗法治疗28例LHON患者，获得了46.5％总有效率【36】。被认为有神经保护作用或抗节细胞凋亡的因子用于LHON急性视力丧失、预防第二眼发生或对高危无症状家系成员的预防治疗，但疗效待进一步观察研究。

异型表达基因治疗对LHON和其他线粒体疾病可能是未来较为有希望的治疗方法之一。这种治疗是指利用核编码转位术合成（ND4含有核苷酸11778位点）正常基因编码的mtDNA，插入灭活后的腺关联病毒载体，编码细胞质中蛋白，然后输入线粒体。这种蛋白质可以增加携带11778位点胞质杂合体3倍的存活率，并能储存ATP合成产物到含有正常mtDNA胞质体的水平，这一疗法亦有待进一步研究。

５.展望

线粒体基因的遗传特征可以解释一部分LHON的发病机制，首先，迄今所有LHON家系均属于母系遗传；该病患者发病时间多数在青壮年时期，这可能与mtDNA遗传趋势有关，由于线粒体细胞内异质性的存在，随着时间延长异常mtDNA在体内蓄积，达到“阈值效应”后导致患者发病。同时由于视神经对氧的需求量较大，从而视神经成为该病的“靶点”。虽然对于LHON的现代研究较多，但仍存在许多尚未解决的问题。一些尤为突出问题，如在LHON患者所有母系相关的家系成员中均携带mtDNA突变，但有人却从未有过临床症状。因此，尽管mtDNA突变的存在对于表型表达是十分重要的，但可能并不足以引起发病；为什么不同基因编码的不同蛋白的多位点mtDNA突变导致该病表达同一的临床表型，而病位仅局限在视神经；按线粒体遗传特征进行推论，随着年龄增长突变基因逐渐增加，患者病情应是逐渐加重的趋势，同时这种突变比率也应可以达到其他组织对氧损伤的阈值，从而出现其他组织的病变，但该病患者的发病规律并非如此；不完全的外显率和倾向男性发病暗示还有其它因素，如核、线粒体基因或者环境因素在发病中起作用；在LHON发病过程中，视力已明显下降，视神经乳头颜色苍白，通常激素冲击疗法无效，这是否证明该病的病理基础与视神经炎性的视神经萎缩不同，该病患者视力自发恢复现象是否提示其他视神经萎缩疾病，在满足相同生理基础条件下也可能出现这种视力恢复等。LHON的病理机制或本质有待进一步从基因、生化、生理、病理学以及中医药学的临床治疗学深入研究。