聚精颗粒联合复方玄驹胶囊对死精子症的作用机制研究

聚精颗粒联合复方玄驹胶囊对死精子症患者顶体酶、核蛋白组型转及精浆超氧化物歧化酶的作用机制研究

卞廷松1,3，徐福松2，谈小林3，杨光3、史兵伟3、周华3

（1.南京中医药大学, 江苏 南京 210046; 2.江苏省中医院, 江苏 南京 210029; 3.常州市中医院 , 江苏 常州 213003）

摘要: 　目的: 研究聚精颗粒联合复方玄驹胶囊治疗死精子症的可能机制，为寻找其作用机制提供新的线索。　方法: 选择死精子症患者69例 ,给予聚精颗粒联合复方玄驹胶囊治疗 3个月 ,治疗前后分别采用精子顶体酶定量、核蛋白组型转半定量、SOD定量和DNA荧光染色精子动（静）态图像分析系统进行检测分析，观察治疗前后精液常规参数以及顶体酶、核蛋白组型转、SOD的变化。并以21例正常生育者作为对照。　结果: 与治疗前相比，治疗后a级精子、 a + b级精子、e级精子百分率及精子顶体酶值均有显著性改变 P <0. 01 ; 精子密度、精子核蛋白组型转换半定量值及精浆SOD值无明显变化 P >0. 05。结论: 聚精颗粒联合复方玄驹胶囊可以显著改善死精子症患者精子活动率 ,但联合治疗的良好疗效可能并不体现在 SOD活性值的改变。死精子症患者的精子顶体酶检测和核蛋白组型转检测有一定的价值，而SOD变化不明显。

关键词: 死精子症;精液参数; 精子顶体酶; 核蛋白组型转换; 超氧化物歧化酶

Clinical study of human spermatozoa acrosin activity、spermatozoa nucleoprotein transition and superoxide dismutase of necrospermia (reports of 69 cases)

       Bian Tingsong1，Xu Fusong2 ，Yang Guang1， Shi Bing-wei1 Mao Wei1，Zhou Hua1

Department of Andrology，Changzhou hospital Affiliated to Nanjing University of TCM，Changzhou, 213003; Department of Andrology，Province hospital of Nanjing University of TCM, Nanjing, Jiangsu, 210029.

Abstract:　Objective: To explore the possible therapeutic mechanism of FUFANGXUANJU Capsule and Jujing granulation on necrospermia. 　Methods: Computer assisted sperm analysis 、spermatozoa acrosin activity 、spermatozoa nucleoprotein transition and superoxide dismutase（SOD）activity in seminal plasma were performed in 69 cases of necrospermia. The changes of sperm parameters、 spermatozoa acrosin activity 、spermatozoa nucleoprotein transition and SOD activity before and after the treatment with FUFANGXUANJU Capsule and Jujing granulation were observed. Compared with 21 men on normal fertility.　Results: Compared with pre-treatment, there was no significant change in sperm concentration、spermatozoa nucleoprotein transition and the activity of SOD，P >0. 05。But rapid motility、forward motility、 percent necrospermia and spermatozoa acrosin activity were changed significantly after the treatment P <0.01 . 　Conclusion: FUFANGXUANJU Capsule and Jujing granulation can significantly improve sperm viability in patients with necrospermia. However, the excellent effects of FUFANGXUANJU Capsule and Jujing granulation are not displayed in the changes of SOD activity. 　 Examination of spermatozoa acrosin activity and spermatozoa nucleoprotein transition are value for necrospermia, the change of SOD activity is not.

Key words: TCM; necrospermia; sperm paremeters; permatozoa acrosin activity; spermatozoa nucleoprotein transition; superoxide dismutase

       不孕不育严重地影响了夫妇之间的感情和家庭生活质量。不孕不育病因中因男方因素的约占４０％左右。由于男性不育症的病因目前尚未完全阐明，顶体酶作为受精过程中的关键----酶，在精子穿透卵细胞透明带时起溶解透明带作用，因而其活性高低可直接影响受孕[1]。在精子发生过程中，如果生精细胞内的核蛋白组型转换异常或受阻可导致男性不育或胚胎早期夭折。研究表明，精浆内存在氧化和抗氧化系统 , SOD作为重要的氧自由基清除剂 ,有维持精子正常形态和功能的作用[2]。本研究观察了69例死精子症患者的精子顶体酶、核蛋白组型转和精浆超氧化物歧化酶（SOD）的变化，现将结果报告如下。

对象和方法

       1. 1　研究对象 　69例患者均为 2005年 9月～2008年 3月在南京中医药大学附属常州市中医院男科门诊就诊者。年龄24~48岁，平均30.57岁。不育病程 1～12年 ,平均 3. 1年。均为婚后 1年以上、未采取任何避孕措施、性生活正常、排除女方不育原因者。无外伤及遗传性疾病家族史，体检未发现有明显睾丸、附睾及输精管异常。无全身和内分泌疾病；抗精子抗体阴性。所有患者精液质量参数按照 WHO《人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册 》第 4版的标准，经分析符合规定：死精子率>40%[3] 

  1.2.1　给药方案 　69例入选患者均口服聚精颗粒（组方：熟地黄１０ｇ，党参１０ｇ，枸杞子１０ｇ，制首乌２０ｇ，制黄精１０ｇ，茯苓１０ｇ，生牡蛎３０ｇ，柴胡10ｇ；江阴天江药业有限公司生产），开水冲成约120 ml／次，复方玄驹胶囊（国药准字Z20003012，施强药业生产）3片，2次／d，早、晚餐后２小时服用，３个月为1疗程。服药期间禁酒。

  1.2.2精液采集 　所有对象治疗前后禁欲 4～7 d [4]，手淫法取精，置于 37 ℃恒温水浴箱内 ,液化后进行分析。

  1. 3　实验室检测

  1. 3. 1 精液常规检查 　取 5μl精液置 MACRO计数板上，以DNA荧光染色精子动（静）态图像分析系统进行精液参数分析（北京航天瑞祺科技发展有限公司）进行精液参数分析。采用 WHO推荐标准 ,测定精液量、精子密度、活动率等。

  1. 3. 2 精子顶体酶定量测定(改良Kennedy法) ⑴每份标本同时设测定管和空白管，每管参加反应的精子数为7.5×106 个。根据标本精子浓度(M×106/ml)，计算每管所需精液量v ml（计算方法：v=7.5/M）。⑵分别于测定管、对照管各加精液v ml，2000g 离心20min。⑶采用试剂盒（深圳华康生物医学工程有限公司生产）检测精子顶体酶。计算公式：

（测定管OD 值— 空白管OD 值）× 2

顶体酶活性(µIU/106 精子)=--------------------------------×106       

495 ×7.5

（测定管OD 值— 空白管OD 值）

=  ×106 

  判断标准：低于48.2 μIU/106精子。（正常值：48.2～218.7 μIU/106精子）

  1. 3. 3 精子核蛋白组型转换半定量检测 ⑴精液液化并计数，以洗涤液调整精子浓度至40×１０６/ml。⑵　取上述调整后的精液1ml，加于Eppendorf 管内，1000g 离心10min，去精浆。加1ml 洗涤液，充分混匀。1000g 离心3 分钟，去上清液，如此共洗涤3 次。最后一次离心弃上清液后，加1ml 粘合液，取5ul 涂片。⑶采用试剂盒（深圳华康生物医学工程有限公司生产）检测精子核蛋白组型转换半定量值。⑷油镜计数200 个精子，不成熟精子头部呈蓝色，计算头部着色精子百分率。

  判断标准：精子核蛋白组型转换半定量检测值：头部染蓝色精子≤30%。

  1. 3. 4 精浆 SOD活性测定 　采用 SOD检测试剂盒(日本岛津公司生产)检测。精液先经3 500 r/min离心 10 min,取上层精浆再5 000 r/min离心 10 min,最后取上层精浆用等渗盐水 1∶10稀释后 ,取 40μl按操作说明书进行。

  1. 4统计学分析  采用SPSS11.0软件包进行统计分析，检测数据用x±s表示，均值比较采用t检验，ｐ<0.01被认为差异有显著统计学意义。精子顶体酶、核蛋白组型转换、SOD与精液参数之间关系采用 Pearson相关性分析。P <0. 05为差异有显著性。

结果

       资料完整的69例死精子症患者，其中精子密度>20×106者56例，精子密度<20×106者13例，a级<25%者58例；本组69例患者中，共有20例发现精子顶体酶异常，占28.99%；14例发现精子核蛋白组型转换异常，占20.29%。69例完成检测患者中，顶体酶正常组和异常组的精子密度、a级精子、（ａ＋ｂ级）精子等主要精液参数指标，均ｐ<0.01，有显著性统计学意义。精子顶体酶与密度、活力a级、活力（ａ＋ｂ级）均成正相关，相关系数分别为：0.104、0.088、0.098，均ｐ<0.05，有统计学意义。

       2. 1　死精子症组精液参数比较 　见表1。与正常生育组相比 ,死精子症组患者的精子密度、a级精子、 a + b级精子及e级百分率差异均有显著性。

表1　69例死精子症患者精液参数和正常生育组的比较（x±s）

 

与正常组比较：＃：ｐ<0.01

       2.2　死精子症组精子顶体酶、核蛋白组型转换、SOD比较 　见表2。与正常生育组相比，死精子症组患者的核蛋白组型转换半定量值和SOD值无显著变化，精子顶体酶值差异有显著性。

表2　69例死精子症患者顶体酶、核蛋白组型转换、SOD和正常生育组的比较（x±s）

 

与正常组比较：＃：ｐ<0.01

        

图1：治疗前 （荧光染色，×20）             图2：治疗后（荧光染色，×20）

治疗前后精子运动轨迹图

1. 讨论

  精子在经过附睾运行后，才逐步获得运动能力，并贮存于附睾尾部而处于静止的状态。只有到了射精时，在与附性腺分泌物充分混合后，才得到充分的运动。运动的精子才能与卵子结合而怀孕。一个良好的环境是精子存活的必备条件，以下因素都是造成精子死亡的病因[3]：①精液中某些精子存活必需的营养物质缺乏引起死亡，即“饥饿性死亡。②生殖道感染时，细菌、炎性细胞的吞噬引起死亡。③精液酸碱度改变(特别6. 5以下者)造成大量死亡。④供氧不足，精子因缺氧中毒死亡。⑤精浆中缺锌，引起死亡。⑥精浆中缺维生素C，引起死亡。⑦某些原因引起的中毒，造成死亡。⑧禁欲过久导致精子在附睾中死亡。⑨某些药物使用过久，导致精子死亡。以上因素导致附睾病理损害时可出现氧自由基大量产生，造成精子严重损害和死亡；而死亡精子的解体及释放的酶系，又可影响还存活的精子，造成恶性循环[4]。

  现今的精液分析，是采用自动分析仪测定精子活率、活力，其中把精子运动速度<5um/s的精子定为极慢或不动精子(D级精子)。其实死精子固然不动，但不动的精子可以是死的；也可以是活的。因此确诊死精子症，我们采用DNA荧光染色精子动（静）态图像分析系统鉴别活精子是绿色，死精子是红色[5,6]。

  我们的研究结果发现：与正常生育组相比 ,死精子症组患者的精子密度、a级精子、a + b级精子及e级百分率差异均有显著性。

  顶体酶是精子顶体内存在精氨酸酰胺酶，其活性可反映顶体酶全部活性，以酶原的形式合成并储存在顶体内。它是受精过程中的一种重要的蛋白水解酶，为精卵结合提供条件〔1〕。顶体酶活性低下会影响对卵细胞卵丘的分解及对透明带的穿透，顶体酶活性是判断精子生育力很有价值的一项指标[7～9]。在精子成熟过程中，精子核DNA与鱼精蛋白的结合越来越紧密，最终形成高度浓缩的精子特异性染色质。这种取代反应的发生对精子的正常发育和能否受精，有极其重要作用[10]。在精子发生过程中，如生精细胞内的核蛋白组型转换异常或受阻可导致男性不育或自发性早期流产。其可能机理为：①使精子DNA不稳定，易受损伤而不能受孕；②一旦受精后，由于核蛋白组型异常，精子核不能正常解聚，从而影响了雌雄原核的融合；③胚胎不能正常发育，致使胚胎早期夭折而流产[11]。

  精子运动功能障碍的原因十分复杂，有精子内在的原因，包括精子运动装置及能量代谢等因素。还有精浆离子成分异常和相互比例失调，也会影响精子的运动[12]。SOD活性受本身产生的影响和产生后 ROS和其他自由基消耗以及破坏的影响。精液 ROS除了可直接造成 DNA链断裂引起突变外，主要是通过脂质过氧化作用影响 DNA，引起 SOD的表达基因的变化，使之合成减少。SOD降低、精子膜自由基反应以及脂质过氧化反应加重从而精子活动率下降[13]。

  有研究显示，核蛋白组型转换和顶体酶活性分别与精子密度、a级及ａ+b级活力之间呈显著正相关[14~16]。我们研究的结果显示，本组69例患者中，共有20例发现精子顶体酶异常，占28.99%，14例发现精子核蛋白组型转换异常，占20.29%。虽然顶体酶值与正常生育组无统计学差异，而核蛋白组型转换与正常生育组有显著的统计学差异。说明精子顶体酶和精子核蛋白组型转换检测可作为了解死精子症患者的一项有价值的可靠指标[17]。同时研究结果表明：正常生育组相比，死精子症组患者的SOD值无显著变化，提示SOD可能不是影响死精子症的重要机制。

  聚精方是徐福松教授根据自己的临床体会组合而成，在临床已使用 30多年。该方由熟地、枸杞子、何首乌、党参、生牡蛎、柴胡、茯苓、黄精等中药组成。本方针对肾精亏损 ,后天化生乏源的主要病理特点，依据阳化气、阴化形的理论，以滋肾填精、补脾助运为治疗法则。方中熟地、何首乌、枸杞子等益肾填精，补肾中阴精不足；茯苓、黄精健脾助运，益后天化生之源以供养先天。诸药共用，脾肾同治，共收滋肾化源，添精助育之功。在改善生精功能，提高精液质量，特别是精子活动力方面显示出良好的效果。同时，聚精颗粒还结合了现代药理研究成果，进行针对性用药，即辩病与辩证相结合。如枸杞子、黄精含锌较高；枸杞子还可以提高血睾酮水平；而熟地、何首乌、茯苓均可显著提高人体免疫力[18~20]。

  SOD活性受本身产生的影响和产生后 ROS和其他自由基消耗以及破坏的影响。精液 ROS除了可直接造成 DNA链断裂引起突变外，主要是通过脂质过氧化作用影响 DNA，引起 SOD的表达基因的变化，使之合成减少。SOD降低，精子膜自由基反应以及脂质过氧化反应加重从而精子活动率下降[13]。本研究精液 SOD值治疗前后的改变，已排除合成SOD障碍，如精子生成缺陷、精子线粒体合成酶基因缺少等可能无法纠正的干扰和影响，因为不可能治疗后再出现如此病因。聚精颗粒联合复方玄驹胶囊能显著改善死精子症患者精子活动率，而且对精子顶体酶的治疗有统计学意义。而本研究精子核蛋白组型转换及精浆 SOD活性治疗前后没有统计学意义，是否表示聚精颗粒联合复方玄驹胶囊显著改善死精子症患者精子活动率，而核蛋白组型转换和SOD不是直接影响精子活动率的因素[21]。死精子症病情复杂，病因众多，所有这些都有待进一步研究和证实。

  尽管精子顶体酶和精子核蛋白组型转换是反映精子质量的重要指标，可对死精子症患者的病因及预后作出更为准确的判断和估计，而且推测它也是反映精子致孕能力的重要指标。但两者并不能绝对预测死精子症患者的生育力，因此精子顶体酶和精子核蛋白组型转换只是从另一方面提供一个了解精子生育力的方法，而这是精液常规分析所不能提供的。对于死精子症的更多认识，有待于进一步的深入研究，需要做好更多的工作。

参考文献

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[2] 赵红光,刘光伟,刘淑春,等. 患糖尿病 12周大鼠睾丸生精细胞周期及其凋亡与抗氧化水平的变化 [J]. 中华男科学杂志,2005,11(10):735-739.

[3] 熊承良主编.人类精子学.2002.第1版.湖北:湖北科学技术出版社：289-291

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